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腫瘤抑制蛋白p53是一種序列特異性轉(zhuǎn)錄因子，通過抑制或激活下游的靶基因來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。功能性p53的缺乏導(dǎo)致致瘤性轉(zhuǎn)化， p53基因的突變也是目前人惡性腫瘤中常見的基因變異之一， 40多年來一直是腫瘤研究領(lǐng)域中重要和活躍的分子之一。近幾年來，科學(xué)家們對p53的異形體越來越多。迄今為止，人們已鑒定出14種天然的p53異形體（isoform）：p53α、p53β、p53γ、Δ40p53α、Δ40p53β、Δ40p53γ、Δ133p53α、Δ133p53β、Δ133p53γ、Δ160p53α、Δ160p53β、Δ160p53γ、Δp53和 p53ψ，而且其中的很多p53異形體能夠?qū)е虏煌纳飳W(xué)表型。
盡管野生型全長p53的功能已得到很好的確定，但是各種p53異形體在衰老、生長率和凋亡中的生理作用以一種復(fù)雜的經(jīng)常明顯存在沖突的方式關(guān)聯(lián)在一起。美國喬治城大學(xué)醫(yī)學(xué)中心細(xì)胞重編程實(shí)驗(yàn)室主任、細(xì)胞永生化科學(xué)家，病理學(xué)系劉學(xué)鋒（Xuefeng Liu）教授及其同事們之前已在體內(nèi)和體外證實(shí)兩種p53異形體---Δ133p53α和p53β---潛在地調(diào)節(jié)人細(xì)胞的增殖并可能調(diào)節(jié)細(xì)胞重編程。
在一項(xiàng)發(fā)表在Nature子刊（細(xì)胞死亡和疾病）的研究[1]中，劉學(xué)鋒教授及其團(tuán)隊(duì)報道了一種以前未有見過報道的有關(guān)Δ133p53α新功能----調(diào)節(jié)條件性細(xì)胞重編程過程和端粒酶的活性。利用他們在2011年開發(fā)出的條件性重編程細(xì)胞（conditional reprogramming cell， CRC）技術(shù)對兩種在體外培養(yǎng)時具有有限增殖壽命（replicative lifespan）的原代人細(xì)胞---從新生兒包皮中分離出的人包皮角化細(xì)胞（human foreskin keratinocyte， HFK）和從正常的成年人前列腺組織中分離出的人前列腺上皮細(xì)胞（human prostate epithelial cell， HPEC）---進(jìn)行條件性重編程，結(jié)果證實(shí)Δ133p53α在這些條件性重編程的HFK和HPEC細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。過度表達(dá)Δ133p53α一致性地延緩細(xì)胞衰老并且讓原代培養(yǎng)的HFK和HPEC細(xì)胞在一種Rho相關(guān)激酶（ROCK）抑制劑的存在下能夠在體外無限地增殖（如圖1所示）。這種Δ133p53α延長的細(xì)胞增殖壽命涉及上調(diào)hTERT表達(dá)和它的端粒酶活性。
圖1，圖片來自Cell Death & Disease， Published online： 03 July 2018， doi：10.1038/s41419-018-0767-7.
鑒于這種CRC技術(shù)發(fā)揮的重要作用，那么到底什么是CRC技術(shù)呢？讓我們先回顧一下這個領(lǐng)域的研究背景。
在此之前，絕大多數(shù)癌細(xì)胞系是利用高分級或轉(zhuǎn)移性腫瘤建立的，而且其中的不少癌細(xì)胞系經(jīng)證實(shí)與其來源的腫瘤存在遺傳上的不同。大多數(shù)原代細(xì)胞系具有有限的增殖次數(shù)，終都因細(xì)胞衰老而具有有限的壽命。迄今為止，科學(xué)家們利用了多種方法來維持原代細(xì)胞的增殖能力。
一種可能是為常見的維持方法是利用病毒癌基因轉(zhuǎn)化原代細(xì)胞。特別地，利用SV40大T抗原或致癌性人乳頭瘤病毒E6/E7蛋白的編碼基因加以轉(zhuǎn)化能夠?qū)е潞芏囝愋偷募?xì)胞永生化。但是，這種基因操縱導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，因此在經(jīng)過幾次傳代后，體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞漸進(jìn)性地積累著基因組變異，這就會導(dǎo)致它們具有不同于它們起源的原代細(xì)胞的表型，比如可能具有異常的p53和Rb調(diào)節(jié)通路。
另一種永生化方法讓一些原代細(xì)胞表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶亞基（hTERT）等外源性細(xì)胞基因就能夠阻止它們的染色體變短，讓它們逃避細(xì)胞衰老，從而導(dǎo)致永生化。盡管過度表達(dá)hTERT并不會導(dǎo)致正常的細(xì)胞發(fā)生癌變，但是所形成的細(xì)胞在經(jīng)過多次傳代后也表現(xiàn)出異常的細(xì)胞特性。
此外，通過導(dǎo)入外源性基因讓皮膚細(xì)胞或血細(xì)胞等體細(xì)胞退回到一種類似于胚胎干細(xì)胞的狀態(tài)，所形成的細(xì)胞被稱作誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）。這種ips細(xì)胞技術(shù)也能夠延長細(xì)胞壽命，但是它的效率相對較低，而且導(dǎo)入外源性基因會誘導(dǎo)細(xì)胞基因組發(fā)生變化，甚至可能誘發(fā)腫瘤產(chǎn)生。
針對現(xiàn)有技術(shù)的這些缺點(diǎn)，2010年，劉學(xué)鋒教授等人發(fā)現(xiàn)在體外利用ROCK抑制劑Y-27632處理三種人原代角化細(xì)胞---人新生兒包皮角化細(xì)胞、成年人陰道角化細(xì)胞和成年人子宮頸外角化細(xì)胞（ectocervical keratinocyte）---能夠極大地增加這些在體外培養(yǎng)時具有有限壽命的人原代角化細(xì)胞的增殖能力，地導(dǎo)致它們永生化[2]。更重要的是，這些永生化細(xì)胞表現(xiàn)出典型的原代角化細(xì)胞特征，而且它們具有正常的二倍體核型和完整的DNA損傷反應(yīng)，此外還能夠經(jīng)分化后產(chǎn)生復(fù)層上皮（stratified epithelium）。這有助于研究很多不同的皮膚上皮和黏膜上皮疾病的致病過程。
在此基礎(chǔ)上，劉學(xué)鋒教授等人在2011年底發(fā)現(xiàn)組合使用ROCK抑制劑Y-27632和經(jīng)過照射的小鼠成纖維細(xì)胞（作為飼養(yǎng)細(xì)胞層）可誘導(dǎo)來自人體很多組織（比如前列腺和乳腺）的正常上皮細(xì)胞和腫瘤上皮細(xì)胞在體外無限地增殖，而無需導(dǎo)入外源性的病毒基因或細(xì)胞基因[3]，如圖2所示。在這種生長條件下，在5至6天內(nèi)可從針刺活組織中培養(yǎng)出2 × 106個細(xì)胞，能夠從低溫保存的組織中培養(yǎng)出大量的細(xì)胞，而且還能夠利用不到4個活細(xì)胞培養(yǎng)出大量的細(xì)胞。持續(xù)的細(xì)胞增殖依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞和Y-27632，因此將這種組合使用產(chǎn)生的細(xì)胞稱為條件性重編程細(xì)胞（conditionally reprogrammed cell， CRC）。此外，這些CRC細(xì)胞保持正常的二倍體核型，而且沒有致癌性。這種CRC技術(shù)也適用于來自人類和嚙齒類動物的腫瘤上皮細(xì)胞。
圖2，圖片來自The American Journal of Pathology， February 2012， doi：10.1016/j.ajpath.2011.10.036.
也正是這種CRC技術(shù)具有以上優(yōu)點(diǎn)，它一經(jīng)問世就引發(fā)人們的極大關(guān)注，并被*不少實(shí)驗(yàn)室采用。基于此，劉學(xué)鋒教授等人在2017年將這種CRC技術(shù)的詳細(xì)步驟發(fā)布在Nature Protocols期刊[4]上，供人們參考。
談了這么多，那么CRC方法的作用機(jī)制什么呢？或者說，在這種方法中，作為飼養(yǎng)細(xì)胞的小鼠成纖維細(xì)胞和Y-27632到底起著什么作用呢？
針對這一點(diǎn)，美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Seema Agarwal和David L. Rimm在一篇評論文章中進(jìn)行了總結(jié)[5]。在這種CRC方法中，經(jīng)過照射而沒有增殖能力的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)和維持原代上皮細(xì)胞表達(dá)hTERT。這種影響很可能是通過細(xì)胞間的直接相互作用或者通過分泌可擴(kuò)散的生長因子和細(xì)胞因子（比如IL-6、HGF和TGFβ等）加以實(shí)現(xiàn)的。它也可能是通過提供一種不可溶的胞外基質(zhì)（ECM）或者通過分泌ECM重塑蛋白（比如MMP-9和MMP-3）加以調(diào)節(jié)的。
經(jīng)過照射的非增殖性成纖維細(xì)胞分泌的生長因子、細(xì)胞因子和ECM重塑蛋白的不確定性組合似乎在維持與飼養(yǎng)細(xì)胞和Y-27632一起培養(yǎng)的原代上皮細(xì)胞的不受限制的增殖潛力中起著至關(guān)重要的作用。此外，另一個潛在地影響這種無限制增殖的變量是將小鼠成纖維細(xì)胞用作飼養(yǎng)細(xì)胞的事實(shí)。盡管這些小鼠成纖維細(xì)胞分泌的蛋白因子可能與人細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白因子是相類似的，但非人細(xì)胞微環(huán)境對人原代上皮細(xì)胞的影響仍未得到充分理解。
這種CRC方法的另一個關(guān)鍵部分是使用一種ROCK抑制劑來協(xié)助維持原代上皮細(xì)胞的未分化狀態(tài)和增殖狀態(tài)。盡管這種ROCK抑制劑的使用不是新的，但是它與飼養(yǎng)細(xì)胞的組合使用似乎在阻止這些體外培養(yǎng)的細(xì)胞衰老方面起著關(guān)鍵性的作用。
為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，劉學(xué)鋒教授等人[3]通過對起源自正常的前列腺和乳腺組織的上皮細(xì)胞進(jìn)行核型分析，證實(shí)它們?nèi)匀槐３侄扼w核型，而且當(dāng)被注射到小鼠體內(nèi)時，它們也不會產(chǎn)生腫瘤。因此，劉學(xué)鋒教授等人[3]證實(shí)組合使用經(jīng)過照射的小鼠成纖維細(xì)胞和這種ROCK抑制劑是它們的初期存活和無限制增殖所*的。移除兩種組分中的任何一種都會導(dǎo)致所形成的CRC細(xì)胞分化，并終導(dǎo)致細(xì)胞衰老。
利用CRC技術(shù)實(shí)現(xiàn)的成體哺乳動物非角化細(xì)胞上皮細(xì)胞無限增殖也為基因療法、細(xì)胞療法、再生醫(yī)療和個性化醫(yī)療提供令人激動的機(jī)會。
比如，2012年，劉學(xué)鋒教授等人利用CRC方法產(chǎn)生源自一名患者的正常肺部組織和肺部腫瘤組織的細(xì)胞培養(yǎng)物[6]，其中這名患者患上20年的復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤病，并且具有進(jìn)行性的雙側(cè)腫瘤浸潤肺實(shí)質(zhì)。分析結(jié)果表明喉部腫瘤細(xì)胞含有一個長7.9kb的野生型人乳頭瘤病毒11型（HPV-11）基因組，而肺部腫瘤細(xì)胞含有一個長10.4kb的HPV-11基因組。 肺部腫瘤細(xì)胞中的病毒基因組的大小增加是由于它的啟動子和致癌基因區(qū)域發(fā)生復(fù)制。化學(xué)敏感性測試鑒定出伏立諾他（vorinostat）是一種潛在的治療藥物。在開始治療3個月后，這名患者的腫瘤大小保持穩(wěn)定，而且在15個月時，這種效果仍是持續(xù)性的。
圖3. CRC方法及其應(yīng)用，圖片來自Nature Protocols， 2017， doi：10.1038/nprot.2016.174。
總之，這種CRC方法具有快速地產(chǎn)生患者來源的原代細(xì)胞的巨大潛力，所產(chǎn)生的原代細(xì)胞可用于多種用途，包括構(gòu)建活的生物庫，探究基本腫瘤生物學(xué)特性，藥物靶標(biāo)識別和藥物發(fā)現(xiàn)等，如圖3所示。特別值得一提的是，今年4月美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）將CRC技術(shù)列為兩種重要的人源癌癥細(xì)胞模型之一 （7），作為接近患者的癌癥生物學(xué)／醫(yī)學(xué)／個體化治療和新藥發(fā)現(xiàn)工具之一， NCI執(zhí)行所長James Doroshow是該項(xiàng)目的倡議和發(fā)起人。
參考文獻(xiàn)：
1. Abdul M. Mondal， Hua Zhou， Izumi Horikawa et al. Δ133p53α， a natural p53 isoform， contributes to conditional reprogramming and long-term proliferation of primary epithelial cells. Cell Death & Disease， Published online： 03 July 2018， doi：10.1038/s41419-018-0767-7.
2. Sandra Chapman， Xuefeng Liu， Craig Meyers et al. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation， July 2010， 120(7)：2619-2626， doi：10.1172/JCI42297.
3. Xuefeng Liu， VirginieOry， Sandra Chapman et al. ROCK Inhibitor and Feeder Cells Induce the Conditional Reprogramming of Epithelial Cells. The American Journal of Pathology， February 2012， 180(2)：599-607， doi：10.1016/j.ajpath.2011.10.036.
4. Xuefeng Liu， Ewa Krawczyk， Frank A Suprynowicz et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols， 2017， 12(2)：439–451， doi：10.1038/nprot.2016.174.
5. Seema Agarwal， David L. Rimm. Making Every Cell Like HeLa： A Giant Step For Cell Culture. The American Journal of Pathology， February 2012， 180(2)：443-445， doi：10.1016/j.ajpath.2011.12.001.
6. Hang Yuan， Scott Myers， Jingang Wang et al. Use of Reprogrammed Cells to Identify Therapy for Respiratory Papillomatosis.New England Journal of Medicine， 27 September 2012， 367(13)：1220-1227， doi：10.1056/NEJMoa1203055.
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