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摘要：毛細管電泳法是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。該技術可分析的成分小至有機離子、大至生物大分子如蛋白質、核酸等。可用于分析多種體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等，比HPLC分析、快速、微量。
關鍵詞：毛細管電泳 原理 分離模式 應用
1、概述
毛細管電泳 (Caillary Electrophoresis)簡稱 CE，是一類以毛細管為分離通道，以高壓直流場為驅動力的新型液相分離分析技術。CE的歷史可以追溯到 1967年瑞典Hjertenzui先提出在直徑為3mm的毛細管中做自由溶液的區(qū)帶電泳(Capillary Zone Electro-phoresis，CZE)。但他沒有*克服傳統(tǒng)電泳的弊端[1]。
現(xiàn)在所說的毛細管電泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他們使用了75mm的毛細管柱，用熒光檢測器對多種組分實現(xiàn)了分離。1984年Terabe將膠束引入毛細管電泳，開創(chuàng)了毛細管電泳的重要分支: 膠束電動毛細管色譜(MEKC)。1987年Hjerten等把傳統(tǒng)的等電聚焦過程轉移到毛細管內(nèi)進行。同年，Cohen 發(fā)表了毛細管凝膠電泳的工作。近年來，將液相色譜的固定相引入毛細管電泳中，又發(fā)展了電色譜，擴大了電泳的應用范圍。
毛細管電泳和液相色譜（HPLC）一樣，同是液相分離技術，因此在很大程度上HPCE與HPLC可以互為補充，但是無論從效率、速度、樣品用量和成本來說，毛細管電泳都顯示了一定的優(yōu)勢毛細管電泳（C E） 除了比其它色譜分離分析方法具有效率更高、速度更快、樣品和試劑耗量更少、應用面同樣廣泛等優(yōu)點外，其儀器結構也比液相色譜（HPLC）簡單。 C E只需高壓直流電源、 進樣裝置、 毛細管和檢測器。
毛細管電泳具有分析速度快、分離效率高、試驗成本低、消耗少、操作簡便等特點，因此廣泛應用于分子生物學、醫(yī)學、藥學、材料學以及與化學有關的化工、環(huán)保、食品、飲料等各個領域[2]。
2 毛細管電泳的設備和基本原理
毛細管電泳法是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法[3]。毛細管電泳儀的基本組成如圖1、1 所示 。
熔融石英毛細管的兩端分別浸在含有電解緩沖液的貯液瓶中，毛細管內(nèi)也充滿同樣的電解緩沖液。在毛細管接收端之前安裝在線檢測系統(tǒng)。被分析樣品可以從進樣系統(tǒng)采用重力法、電遷移法、抽真空法等多種進樣方式引入到毛細管的進樣端。當樣品被引入后,便開始在毛細管兩端施加電壓 。樣品溶液中溶質的帶電組分在電場的作用下根據(jù)各自的荷質比向檢測系統(tǒng)方向定向遷移。CE中的毛細管目前大多是石英材料。當石英毛細管中充入 pH值大于 3的電解質溶液時 ,管壁的硅羥基(- SiOH)便部分解離成硅羥基負離子(- SiO-) ,使管壁帶負電荷。在靜電引力下 ,- SiO-會把電解質溶液中的陽離子吸引到管壁附近，并在一定距離內(nèi)形成陽離子相對過剩的擴散雙電層 (見圖 2[4])。
在外電場作用下 ,上述陽離子會向陰極移動。由于這些陽離子實際上是溶劑化的(水化的)，它們將帶著毛細管中的液體一起向陰極移動，這就是 CE中的電滲流(EOF)。電滲流的強度很高，以致于所有進入毛細管中的樣品，不管是陰離子、陽離子或中性分子，都會隨著液體向陰極移動。因待測樣品中正離子的電泳方向與電滲流方向一致，故zui先到達毛細管的陰;中性粒子的電泳速度為零 ,遷移速度與電滲流速度相當；而負離子的電泳方向則與電滲流方向相反，但因電滲流速度約等于一般離子電泳速度的 5～7倍[5]，故負離子也將在中性粒子之后到達毛細管的陰。由于各種粒子在毛細管內(nèi)的遷移速度不一致，因而使各種粒子在毛細管內(nèi)能夠達到很好的分離。
3 毛細管電泳的分離模式
根據(jù)分離原理不同，CE分離基本模式有6種，如表 1 所示。
以上各模式以毛細管區(qū)帶電泳、毛細管凝膠電泳、膠束電動毛細管色譜這3種應用較多。
4 、毛細管電泳的應用
4.1 CE在藥物成分分析中的應用
目前，CE在天然中草藥分析領域中的應用主要集中在生物堿和黃酮及其甙類方面、蒽醌類分析也有報道。生物堿有類似于堿的性質，在pH < 7的緩沖液中利用 CZE 分離。紀秀紅等[6]選取馬qian子jian為內(nèi)標物，在磷酸/甲醇緩沖溶液中 ,測定了小檗堿、巴馬亭、藥根堿的含量。黃酮類化合物大多是中性分子，主要采用 MECC 模式分離。LiYM[7]以SDS(十六烷基磺酸鈉)為陰離子表面活性劑將黃芩中的 6 種主要的黃酮類化合物分離。李偉等[8]以磷酸鹽為緩沖體系 ,利用 CZE模式分離、 測定了大黃提取液中離蒽醌化合物的含量。
4. 2 CE在手性拆分中的應用
CE因其、快速、選擇性強的特點而成為目前zui有效的手性拆分方法。各種CE分離模式皆可用于對映異構體分離，因此手性拆分成為 CE應用zui活躍、 zui*的領域。其中，添加劑法只需向電泳緩沖液中加入合適的手性試劑，經(jīng)過一定的分離條件優(yōu)化即能實現(xiàn)手性分離。又因為可選擇的添加劑種類很多，此法是 CE進行手性拆分的主要形式。目前 ,主要的手性添加劑有環(huán)糊精類（CDs)、冠醚類、大環(huán)抗生素、蛋白質等。僅環(huán)糊精一類就有α-CD，β-CD，γ-CD，HP-α-CD， CM-β-CD 等多種添加物質 ,其應用十分廣泛。此外，其他種類添加劑的應用結合 MECC和 NACE 模式基本上能實現(xiàn)各種手性藥物的拆分[9～11]。
4.3 CE用于肽和蛋白分析
CE在蛋白質分離分析中的應用主要包括肽和蛋白的鑒別分析、結構分析、微量制備，蛋白的定量測定、純度檢測、非均一性檢測、定性和動力學研究。CE在肽和蛋白質的別分析中應用zui多的是CZE測定肽譜， SDS-CGE測蛋白分子量及CE-MS直接測定分子量。用CZE還可測定蛋白的物理參數(shù)，如蛋白的有效尺寸、電荷和擴散系數(shù)。用CIEF測定蛋白等電點比平板凝膠電泳測等電點的方法簡單
4.5 CE在臨床化學上的應用
CE 在臨床化學中的應用十分廣泛, 所檢測樣品的來源可分為尿樣、血漿血清、腦脊液、紅細胞、其它體液或組織以及實驗動物活體(invivo)試驗。被分析的組分則包括肽類、各種蛋白、病毒、酶、糖類、寡核苷酸、DNA、小的生物活性分子、離子、藥物及其代謝產(chǎn)物。具體應用可分為: 臨床疾病診斷 臨床蛋白分析、 臨床藥物監(jiān)測、代謝研究、病理研究、同工酶分析、聚合酶鏈反應(PCR )產(chǎn)物分析、DNA pian斷及序列分析等。所應用的CE 模式包括CZE、MECC、CGE、 CITP 和毛細管等電聚焦(CIEF)[13.14]。
4.6 CE用于檢測非均一性(多樣性, Heterogeneity)
許多純化蛋白, 甚至在它們的天然狀態(tài), 往往都不是單一分子片斷, 而是由相關分子組成, 稱為非均一性(多樣性)。產(chǎn)生多樣性的原因有: 氨基酸(AA )的序列不同, 如突變體的某位置AA 改變或AA 側鏈改變; 后轉譯產(chǎn)生不同長度的多肽鏈; 糖蛋白不同程度的糖基化, 如存在不同數(shù)量的寡糖鏈, 寡糖鏈有不同的單糖組成、 序列及單糖之間的異構連接。 采用CZE, MECC, CIEF, CE-MS 可檢測這些非均一性。用于心臟病的重組人組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(rtPA )含 4 個可能糖基。Yim [15]用 CZE 和CIEF 研究了制備過程中 rtPA 不同糖基化程度引起的非均一性, 結果表明, CIEF方法要比CZE的好。還有用CZE 對人促紅細胞生成素( rHuEPO )[16]、用MECC對重組人C2干擾素(IFN2C)[17]及CE-MS[18]研究蛋白的多樣性。有關蛋白的非均一性在臨床中的一些應用, 如人鐵傳遞蛋白、血清蛋白的變異、異構酶的分析等。
4. 7 CE用于農(nóng)藥殘留量的分析
對農(nóng)藥殘留物的測定國外研究的較多。Lazer等[19]將飛行時間質譜和毛細管電泳儀聯(lián)用，采用樣品堆積技術進樣對 Paraquat 和 Diquat 兩種除草劑進行了分離，檢測限低至 10- 17mol/L。Farran等[20]采用φ(乙腈) = 50 %的磷酸-硼砂緩沖液分離出兩種苯氧羧酸類除草劑。Hinsmann 等[21]通過自動在線濃縮樣品， 采用固相微柱以十二烷基硫酸鈉(SDS)作膠束 ,添加少量乙腈 ,在13min內(nèi)分離測定了水中的7種不同種類的農(nóng)藥。磺酰脲類化合物是一類相對較新的除草劑 ，因此這一類化合物在水和食品中的殘留量的測定十分重要。Lipez Avila等[22]采用3μmODS硅膠填充柱來分離這一類化合物 ,線性范圍為1～100mg/L。Mayer等報道了農(nóng)藥Cinosulfuron 及其副產(chǎn)物的毛細管電色譜的分離分析。游靜等[23]對毛細管電泳在農(nóng)藥手性拆分的進展做了綜述。
4.8 CE用于純度檢測
CE在國外分子生物學實驗室及生物工程藥廠里已廣泛用作zui有效的純度檢測手段。當?shù)鞍椎氖杷韵嘟鼤r, 它們在HPLC 柱中往往同時流出, 因此在對蛋白進行結構研究(包括N 端序列和肽譜)之前, 必須監(jiān)測從HPLC 所得肽片斷的純度。快速CE 純度檢測可節(jié)約樣品和節(jié)省序列測定所需時間。因CE 和RP2 HPLC 分離機理不同, 所以當用CE 檢查由RP2HPLC 純化制得的某一合成肽(一個峰, 純度為 99.12% )時, 發(fā)現(xiàn)分出 6 個組分, 主峰純度僅為50%。或許這就是部分基因工程產(chǎn)品用HPLC 檢測純度很高而實際生物活性卻各批差異很大的一個原因。至于用CE 對藥廠生產(chǎn)及QC 作純度檢測的應用實例比比皆是, 如對胰島素、白細胞介素、人生長激素、粒性巨噬細胞菌落刺激因子(用CIEF )等的檢測。純度檢測時用CE 可檢測出多肽鏈上單個氨基酸的差異。CE 用于純度檢測可用CZE,MECC, SDS2 CGE, CIEF 多種模式。還有文獻討論了用不同方法(包括RP2 HPLC, IEC2 HPLC, SDS2PA GE 及CE)進行純度檢測的zui有效的策略[24]。
5 結 論
作為一種蛋白質、多肽、核酸及其他生物分子分離和分析的重要技術，近20年來，毛細管電泳的機理探索和應用研究都取得了長足的進展，對毛細管電泳的研究， 使其分離效率和分析精度不斷提高，也使其應用領域不斷擴大，推動了生物技術的不斷發(fā)展。毛細管電泳今后發(fā)展方向仍是繼續(xù)提高分辨率、速度和檢測器的選擇性。同時，增加自動進樣裝置和使之微機化、商品化。另外，將它與質譜儀更好地結合，可對生物分子特性作出更快、更準確的分析，以進一步拓寬毛細管電泳在生物領域的應用范圍。
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